《中药生物技术实验》教学大纲

一、基本信息

二、课程简介

本课程主要设计了基本组织培养技术为主的实验内容，因为生物技术的绝大部分都要求在无菌条件下进行，组织培养和细胞培养的应用广泛，如药用植物快繁、脱毒培养、花药培养、原生质体和体细胞杂交、农杆菌介导的转基因等，这些均是组培技术为基础。因此该实验涵盖了组培技术的各环节，MS母液和工作液的配置、各种器械用品的灭菌、外植体消毒、无菌接种技术、培养技术、快繁技术中实现组织全能性的激素作用实验等内容。

三、课程目标

要求学生掌握组织培养技术，使学生掌握利用组培技术进行的等方面的应用，以及要求学生掌握遗传转化的原理和技术，使学生掌握药用植物利用转基因进行次生代谢物的生产和重要性状的遗传转化等方面的应用。

1. 通过本课程的学习，加深对《中药生物技术》基础理论、基本知识的理解，使学生获得生物技术的基本实验技能； 

2.学生掌握植物组织培养技术，使学生掌握利用组培技术进行具体应用，如快繁、脱毒培养、花药培养等，同时这也是进行转基因的基本环节；

3. 培养学生理论与实践相结合、综合运用所学知识分析问题和解决问题的能力。

四、课程目标对毕业要求的支撑关系

五、先修课程

《中药生物技术实验》是中药资源与开发专业高年级学生的必修专业实验课，之前应先修《分子生物学》，《分子生物学》是该专业课程教学不可分割的一部分，它与课堂教学密切配合，侧重于学生感性认识、动手能力、创新思维意识、实践能力的培养，具有一定的完整性和独立性。

六、教学内容

实验项目一：MS基本培养基配制及灭菌                         3学时

1.1实验类型：综合设计性实验：

1.2实验目的：理解MS各成分的主要作用，掌握MS母液配置的意义和配置；MS工作液配置及其灭菌技术。

1.3实验内容：MS母液配置、MS工作液配置、利用灭菌锅对培养基等用品的灭菌

（1）MS母液配制方法与步骤

l 10倍大量元素母液（1000ml）的配制

1）称取NH4NO3 16.5g，KNO3 19 g，放入烧杯中，用少量蒸馏水（约100ml）溶解；称取KH2PO41.7 g放入烧杯中，用少量蒸馏水（约100ml）溶解；称取MgSO4·7H2O 3.7 g 放入烧杯中，用少量蒸馏水（约100ml）溶解；称取CaCL2·2H2O  4.4 g 放入烧杯中，用少量蒸馏水（约100ml）溶解（也可单独配制成100倍母液）。

2）混合：于容量瓶中依次混合上述已溶解的药品；

3）定容：加蒸馏水定容至1000ml，即成浓缩10倍的大量元素母液。

l 100倍的微量元素母液（1000ml）的配制

1）称量：用电子分析天平准确称取下列药品，分别放入烧杯中，H3BO3    0.62 g  MnSO4.4H2O  2.23 g ZnSO4·7H2O    0.86 g  KI  0.083 g Na2Mo4·2H2O  0.025 g  CuSO4·5H2O  0.0025 g  CoCL2·6H2O0.0025 g  加少量蒸馏水（约600ml）溶解；

2）定容：溶解后的上述溶液转入1000 ml的容量瓶，蒸馏水定容，即成100倍的微量元素母液。

l 100倍的微量元素母液（500ml）的配制

1）称量：用电子分析天平准确称取下列药品，分别放入烧杯中， H3BO3    0.31 g  MnSO4.4H2O  1.12 g ZnSO4·7H2O    0.43 g  KI  0.042 g Na2Mo4·2H2O  0.0125 g  CuSO4·5H2O  0.0013 g  CoCL2·6H2O0.0013 g  加少量蒸馏水（约200ml）溶解；

2）定容：溶解后的上述溶液转入500 ml的容量瓶，蒸馏水定容，即成浓缩100倍的微量元素母液。

l 100倍铁盐母液（500 ml）的配制

1）称量：称取下列药品，分别放入烧杯中，用少量蒸馏水（约100ml）溶解；

FeSO4·7H2O 1.39 g   Na2-EDTA  1.865 g

2）混合：于500 ml烧杯中依次混和两种溶液；

3）定容：上述溶液转入500 ml的容量瓶，蒸馏水定容，即成浓缩100倍的铁盐母液。

l 50倍有机物质母液（500 ml）的配制

1）称量：电子分析天平称取下列药品，放入烧杯中；肌醇 2.5 g  甘氨酸  0.05 g  烟酸（Vpp）  0.0125 g  盐酸吡哆醇（VB6）  0.0125 g  盐酸硫胺素（VB1）  0.0025 g用少量蒸馏水（约300ml）溶解

2）定容：上述溶液转入500 ml的容量瓶，蒸馏水定容，即成浓缩50倍的有机物质母液。

l 激素类母液的配制

1）称量：用电子分析天平准确称取下列激素类药品各0.1g：IBA、NAA、2,4－D；6－BA。

2）溶解：生长素类（IBA、NAA、2,4－D）可先用少量0.1mol∕LNaOH或95%酒精溶解；细胞分裂素类（6－BA）可先用0.1mol∕L的 HCL溶解；

3）定容：将上述已溶解的各激素溶液分别加蒸馏水定容至100ml，即成浓缩至1mg∕ml的激素类母液。

（2）1000 ml MS培养基的配制与分装

按照母液顺序和所需量，用量筒和专一对应的移液管依次量取下列各母液于容量瓶中；

1）10X大量元素母液：100ml； 2）100X微量元素母液：10 ml；3）100X铁盐母液：10 ml；4）50X有机物质母液：20 ml;  5)加蒸馏水至700 ml左右。

称取6～10g琼脂和30g蔗糖

调pH：用酸度计或pH试纸测试pH值，可用0.1mol∕LNaOH或0.1mol∕L HCL将其调到5.8左右。

（熔化（熬制）：加热煮化。先用旺火烧开，再用文火煮溶。注意经常搅拌，防止糊底和溢出。

调pH：待培养基冷却至45℃左右，用酸度计或pH试纸测试pH值，可用0.1mol∕LNaOH或0.1mol∕L HCL将其调到5.8左右（或用经验法）。

注意：1).培养基适宜PH值5-6.5，一般为5.8，调整用0.1M的NaOH和HCl溶液 。

2)ｐH影响培养基的硬度。

ｐH ＞6.5      培养基会变硬，影响营养成分吸收。

ｐH ＜5.0      培养基不易凝固。

3)灭菌之前，培养基的ｐH要比标准提高0.2－0.3个单位。

分装与扎口：将调好pH值的培养基分装到培养瓶内。每瓶装20～30ml左右的培养基。分装后拧上瓶盖，贴上标签，注明培养基的名称、配制时期,配制人姓名或编号等。

每人制备2瓶MS固体培养基，100 ml 培养基可分装3-4瓶，每组5人，可配制300 ml培养基平均分装入10瓶中。每组需准备2瓶无菌水，4盒灭菌滤纸。

2、培养基的灭菌

1.4教学目标：掌握MS母液配置的意义和配置过程、注意事项；MS工作液配置、理解各成分的主要作用；掌握培养基灭菌技术-高温高压灭菌技术及其灭菌锅的正确使用。

实验项目二：药用植物无菌苗获得                             3学时

2.1实验类型：综合设计性实验：

2.2实验目的：通过在超净工作台上进行无菌操作验练，使学生初步掌握外植体的消毒处理技术、组织培养的无菌操作技术。

2.3实验内容：以决明子（或花生幼胚或丹参种子）为外植体，进行消毒处理和无菌条件下的接种、培养。

（1）在接种前4h用甲醛与高锰酸钾混合薰蒸接种室，并打开紫外灯照射30min；

（2）正式接种前半小时左右，打开超净工作台上的紫外灯和风机，20～30min后接种；

（3）用肥皂水洗净双手，在缓冲间内穿好灭过菌的实验服、帽子与拖鞋，进入接种室；

（4）用70%-75%的酒精擦拭工作台面和双手；

（5）用蘸有70%-75%酒精的纱布擦拭装有培养基的培养器皿，放进工作台；

（6）把解剖刀、剪刀、镊子等器械浸泡在95％酒精中，在火焰上灭菌后，放在器械架上；

（7）把植物材料放进70%-75%的酒精中浸泡约30s，再在0．1％的升汞中浸泡5～10min，或在10％的漂白粉上溶液中浸泡10～15min，浸泡时可进行搅动，使植物材料与灭菌剂有良好的接触；然后用无菌水冲洗3～5次；

（8）用火焰烧瓶口，转动瓶口使瓶口各部分都烧到，打开瓶盖；

（9）取下接种器械，在火焰上灭菌；

（10）把培养材料迅速放入培养瓶，扎上瓶口（每人接种5～10瓶）。操作期间应经常用75％酒精擦拭工作台和双手；接种器械应反复在95％的酒精中浸泡和在火焰上灭菌；

（11）接种结束后，清理和关闭超净工作台。

每人取18粒表面消毒的的花生胚，在无菌滤纸上切除胚根，切口向下将胚芽接种到MS固体培养基上，每瓶接种8-10个胚芽。培养瓶上贴标签注明姓名、班级和接种日期，放在培养室内培养。接种一周后，观察接种材料的污染情况，并分析污染原因。

2.4教学目标：理解外植体含义、外植体取材重要性；掌握外植体的消毒处理技术和无菌接种技术。掌握污染、玻璃化苗出现原因和防止措施、理解激素作用。

实验项目三：诱导培养基的配制和灭菌                         3学时

3.1实验类型：综合设计性实验：

3.2实验目的：掌握分化培养基基的制备、灭菌。

3.3实验内容：设计以无菌苗叶片为外植体，配置用于诱导愈伤分化的培养基、用于分化不定芽的培养基、用于分化生根的培养基，并进行灭菌处理备用。

1）、诱导胚性愈伤培养基MSD：MS+10 mg/L 2,4-D

2）、诱导再生不定芽培养基MSB：MS+4 mg/L BA + 1mg/L NAA

3）每人制备1瓶MSD和1瓶MSB培养基，制备方法同实验一。

4）准备无菌滤纸和酒精棉球

3.4教学目标：为掌握、理解植物激素在植物分化培养的作用准备培养基，掌握生长素和细胞分裂素在分化培养中作用。

实验项目四：激素在植物分化培养的作用                        3学时

4.1实验类型：验证性实验，综合设计性实验：

4.2实验目的：理解植物激素在植物分化培养的作用。

4.3实验内容：设计以无菌苗叶片为外植体，先后分别接种于诱导愈伤、分化不定芽的培养基，观察各种培养基中材料的生长。

（1）超净工作台灭菌：接通电源，打开紫外灯照射20min。同时打开风机20min；

（2）人员准备：洗净双手，穿上实验服进入接种室。在超净台内用酒精棉球擦拭双手，台面及接种工具、种苗瓶表面。取空白培养瓶放入超净台内；

（3）转接：将酒精灯放在距超净台边缘30cm，正对身体正前方处。将种苗瓶放在灯前偏左处，空白瓶放在灯前处，消毒瓶放在灯右处，以利方便操作；打开原种瓶，将瓶口过火一次，置于一定位置。剪刀和镊子灼烧灭菌后，用镊子将原种瓶内一株试管苗取出，在无菌培养皿内切取小叶片。打开空白瓶，瓶口过火一次，用过火、冷却的镊子夹住小叶片迅速转接在空白瓶中，每瓶8－10个，接完后瓶口过火封口。以后重复上述动作。

（4）每接1瓶后，再用酒精棉球擦拭双手一次，以防交叉感染；

（5）接完后，写明标签，移出超净台；

（6）转接结束后，将材料放在培养室内培养。3天后检查污染情况，及时清除。

4.4教学目标：根据结果，理解各激素及其配比在各种分化培养中作用。

实验项目五：  农杆菌介导的植物基因转化技术                   8学时

5.1实验类型：验证性实验：

5.2实验目的：掌握根癌农杆菌侵染植物获取转基因材料的方法；理解农杆菌介导途径进行基因转化的机理；了解转基因植物筛选的方法。

5.3实验内容：

l 试剂的配制

（1）YEB培养基：牛肉膏（5g/L），酵母抽提物（1g/L），蛋白胨（5g/L），蔗糖（5g/L），MgSO4（2mmol/L） pH7.2。固体培养基含琼脂15g/L。

（2）花生分化培养基：Ms + 4mg/L 6-BA + 1mg/L NAA

（3）卡那霉素（Kan）母液：100mg/ml，过滤除菌，分装，－20℃保存。

（4）头孢霉素（Cef））母液：100mg/ml，过滤除菌，分装，－20℃保存。

l 2．农杆菌培养

（1）挑取携带植物表达载体质粒的农杆菌单菌落，接种在20ml含50mg/L Kan的YEB液体培养基中，28℃，180rpm振荡培养过夜。

（2）活化过夜的农杆菌按1:50的比例接种在相同的YEB液体培养基中，继续培养至对数生长期。

（3）5000rpm离心5min，收集菌体，用1/2Ms液体培养基悬浮至OD600=0.1～0.6，准备感染用。

l 外植体的侵染及共培养

（1）取花生无菌菌叶片，切成4～6mm的叶盘（或用打孔器制取），叶盘外植体浸入农杆菌菌液（OD600=0.1）中，感染10min，取出外植体用无菌滤纸吸去附着的菌液。

（2）将浸染过的外植体接种在分化培养基上，暗培养3－7天。

l 4．选择培养

将共培养的外植体转移到含500mg/L Cef和200mg/L Kan的MSB+4.0mg/L BA＋1mg/L NAA培养基上继续培养, 25℃，光照培养。

l 继代培养：每隔2～3周继代一次。

l 筛选2－3周，统计抗性芽丛（或愈伤）的百分率。

5.4教学目标：掌握农杆菌介导途径进行基因转化的机理及操作步骤，根据实验结果，分析影响基因转化效率的因素。

七、课程教学内容对课程教学目标的支撑关系

八、考核评价

九、思政德育教学案例

案例1

名称：组培实验室的常规安全等培训

育人目标：安全教育、探索精神：实验课是教学必不可少的重要部分，也是潜移默化、润物无声培养学生的科学精神、科学思维、科研习惯的主阵地。

结合实验：实验项目一MS基本培养基配制及灭菌

案例内容：实验教学过程中要求学生实验台面清洁、显微镜等仪器等按要求整理，勤俭节约培养学生良好的实验习惯。通过预习和视频学习确定实验操作细节，自然而然帮助学生树立客观、严谨的科学态度；开展小组分工协作实现对学生团队协作精神的培养；正确使用和回收各种试剂和用品，保护自己并防止环境污染，则无形中培养了学生的安全意识和环境保护意识。

案例2

名称：中国首位诺贝尔生理学奖得主屠呦呦

育人目标：不懈奋斗、勇于钻研、矢志不渝的钉子精神

结合实验：无菌苗的培养

案例内容：屠呦呦团队克服各种困难，为实现青蒿素和双氢青蒿素的批量生产打下了坚实的基础，为防治疟疾解救了全球特别是发展中国家的数百万人的生命，强烈的社会责任感和历史使命感，几十年的坚守和努力，这就是我们的科学工作者的人生态度。

案例3

名称：转基因和基因编辑技术

育人目标：激发学生学习精神，鼓励学生要学好知识，投入科研，以拼搏之心，铸科技强国

结合实验：实验项目五农杆菌介导的植物基因转化技术

案例内容：当前基因编辑技术热点，举例阐述基因编辑技术在精准治病、定向改良农作物性状方面的巨大优势，让全体学生一定要领会到生物技术的重要性。

十、应用型教学案例

案例1

名称：德州庆云镇-石斛小镇

育人目标：了解组培快繁过程

结合实验：无菌苗的培养

案例内容：以德州庆云镇发展石斛种植为例，介绍植物种苗“生产车间”的价值

案例2

名称：激素的发现和应用

育人目标：理解植物激素在组培中作用

结合实验：激素在植物再生中作用

案例内容：以组培技术发展历程说起，因外植体不同再生能力，发现激素在再生中作用。

案例3

名称：“胡氏细胞株”

育人目标：理解毛状根培养技术在药效成分合成中作用

结合实验：转基因技术

案例内容：以“胡氏细胞株”为例，说明毛状根的价值和我国研究进展。

十一、教材及学习资料

(一)选用教材

教材类型：其他

教材使用情况：选用

教材名称：

[1]．分子生物学实验指导，刘进元等编著，清华大学出版社，2002

[2]．植物基因与分子操作，顾红雅等编著，北京大学出版社，1995